植物害蟲超微形態鑑別技術之應用(農委會)

而昆蟲之分類鑑定除昆蟲個體本身外，亦包含其所產出之產物如巢穴、排泄物等。

近年來，由於分子生物技術的發達，害蟲的鑑定方法不再侷限於外部形態的鑑定；目前應用於鑑定 ... A 植物害蟲超微形態鑑別技術之應用(農委會) 行政院農業委員會全球資訊網 現在位置:首頁>統計與出版品>農業出版品>農政與農情>92年（第127－138期）>92年6月（第132期）>植物害蟲超微形態鑑別技術之應用 統計與出版品 植物害蟲超微形態鑑別技術之應用 植物害蟲超微形態鑑別技術之應用 農委會防檢局　張世忠 台灣大學昆蟲系　蔡偉皇、蕭旭峰 一、前言 　　分類學家目前是以界、門、綱、目、科、屬、種等七個基本階層對生物做一有系統之分類，昆蟲被歸入為動物界、節肢動物門中之昆蟲綱，再依其形態特徵及生態習性將昆蟲綱分成若干目，普遍認為分成三十二目，然而，因分類學者見解不同，與採用之分類系統略有差異，以致部分昆蟲種類分類方式與分類地位仍須確認。

而為何要進行昆蟲分類？主要在研究從以前至現在所有出現之昆蟲的分類地位，進而依其特徵與食性，查定其種名；另外，則是在探討昆蟲演化發生系統，用以說明昆蟲彼此間及和其它動物之間的類緣關係。

　　昆蟲種類繁多，昆蟲的分類鑑定更是研究昆蟲學之重要基礎，當發現昆蟲時，可依其形態特徵，先確定其屬於那一目後，再依各科特色，陸續進行分科，屬及種之鑑定。

雖然某些特定目之昆蟲有百分之八十以上之種類屬於植食性害蟲，但並非所有出現在植物上之昆蟲都是該植物之害蟲，一般是以其對人類經濟上或實質上之利益、損害來作區分，楊正澤氏等(1999)認為當昆蟲取食人類所需要之動植物本體或其產物時謂之害蟲。

正因昆蟲種類多，亦有益蟲、害蟲之分，全面性的撲殺植物或其產品上之昆蟲，非但不符經濟效益，更可能破壞生態平衡；因此，有系統的昆蟲分類鑑定工作、快速準確的鑑定技術及適當的診斷鑑定工具，是保障農業生產環境安全之第一道防線。

二、植物害蟲之鑑定方法 　　台灣由於地處亞熱帶氣候適宜，農作物栽培種類繁多且作物進出口頻繁，所以稱得上是外來檢疫害蟲侵入的高危險地區，而進出口農產品檢疫業務中，害蟲種類之鑑定為極重要之項目，然而害蟲的卵、若蟲或雄蟲之分類，限於形態不穩定或特徵不明顯，常難以鑑定，通常幼體時期必須飼養至成蟲後方能鑑定種類，其所耗費之時間甚多，不利農產品貿易。

因此，多元化之害蟲鑑定技術，並能廣泛適用於各種生長期，只需少數標本即能完成鑑定的工作，是落實害蟲防疫檢疫最基本之要求。

　　昆蟲的分類鑑定是一門相當專業之科學，特別是在種的鑑別上，一般人更是難以區辨，唯有透過文字圖鑑描述或專人指導，才能有深一層之認識。

一般昆蟲分類鑑定方法係以形態特徵針對傳統分類特徵明確已知之分類群作正確鑑定，通常是藉由檢索表，加上解剖或光學顯微鏡輔助，比對昆蟲各項形態特徵後，始確定其種。

而所謂檢索表，乃是特定專家先歸納出高階分類群，再依各分類群整理分類特徵，彙整基本辨識資料及鑑定技術後而成，更進一步建立圖索表時，可使鑑識人員依分類學之檢索特徵或診斷特徵，找出關鍵差異，以利辨識。

而昆蟲之分類鑑定除昆蟲個體本身外，亦包含其所產出之產物如巢穴、排泄物等。

　　近年來，由於分子生物技術的發達，害蟲的鑑定方法不再侷限於外部形態的鑑定；目前應用於鑑定植物害蟲之分子生物技術中，又以聚合(酉每)連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)技術最為普遍被運用，PCR技術應用上最關鍵之要素為專一性引子對，一對可順利增幅出害蟲核酸物質上特異性片段用以驗明正身之引子對，配合PCR測試儀及適當的反應條件，即可在數小時內完成鑑定工作。

為提昇鑑定之效率與準確率，PCR技術的應用更加多元化，包括於測試時置入多組之引子對，用以偵測兩種以上PCR產物之Multuplex-PCR技術；或利用PCR技術中引子逢機性增幅測試物DNA片段，比對反應產物電泳分析圖譜差異，鑑定其類緣歸屬之RAPD-PCR技術(逢機增幅多形性去氧核(酉唐)核酸，RandomamplifiedpolymorphicDNA)；亦或將PCR技術所增幅出之DNA片段再利用限制(酉每)切割，經電泳分析後比對其限制(酉每)圖譜差異，用以判別是否為同族群或同種之PCR-RFLP技術(聚合(酉每)片段多形性分析，Restrictionfragmentlengthpolymorphism)等。

　　除了PCR技術外，目前應用在植物害蟲鑑定上之分子生物技術尚包括同功異構酶型態分析(Isozymepatterns)、DNA指紋技術(DNAfingerprinting)、微衛星DNA(microsatelliteDNA)或迷你衛星DNA(minisatelliteDNA)之應用、DNA定序等。

此外，目前已有專家針對特定植物害蟲研發建立特定種類害蟲之專一性探針(probe)，日後可配合微陣列設備(microarray)及核酸微陣列點樣系統(spottingsystem)製成可同時鑑定多種重要害蟲或同種不同生理小種之基因晶片(DNAchip)。

三、電子顯微鏡概述 　　自從1665年虎克利用自製之顯微鏡觀察軟木塞的切片，看見了如蜂窩般之細胞後，徹底改變了人類對物體的看法，由個體慢慢到器官、組織、細胞、甚至小到分子、原子等。

1932年，德國科學家利用電子替代可見光製成了電子顯微鏡，並應用於生物學研究之後，使得生物學的領域更加擴大，進入超微世界。

　　電子顯微鏡(Electronmicroscopy)，一般依成像的過程和構造的複雜性，可分為掃描式(scanningelectronmicroscope；SEM)和穿透式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope；TEM)等二大類。

穿透式電子顯微鏡之成像原理為一電子束源，透過磁場線圈（maganeticcoil）進行電子束之聚焦，而磁場線圈是將電子束聚焦在標本上，形成標本的初級影像，而後將初級影像再放大，成像在螢光板上。

掃描式電子顯微鏡之成像原理是利用電子束掃描試片的表面，並將表面產生之訊號包括二次電子、背向反射電子、吸收電子、X射線等，加以收集經放大處理後，輸入到同步掃描之陰極射線管，以顯現試片圖形之影像。

　　穿透式電子顯微鏡的影像來自穿透標本的電子束，一般運用在金屬、高分子、電子、陶瓷材料與生醫試片的內部結構之微觀組織分析與缺陷之觀察。

掃描電子顯微鏡的影像是收集由標本反射的二級電子束所形成的，故其解像力不如穿透式電子顯微鏡，但也就是它這種特性，可以觀察到穿透式電子顯微鏡所無法觀察到的生物體或細胞表面構造。

因此，應用電子顯微鏡進行植物害蟲超微形態之鑑定一般均使用掃描式電子顯微鏡。

四、應用之材料與方法 (一)雙翅目害蟲標本收集 至全省各地以誘引器或黃色黏板誘集所得之標本。

透過管道與世界各項相關昆蟲分類學者聯繫取得世界各地之果實蠅與潛蠅類害蟲標本。

(二)標本製作與保存 　　成蟲標本之製作為了方便以後的操作，採三角紙黏貼或針插標本(黏貼用之膠採主成分為聚醋酸乙烯樹脂)，為了保持體表不凹陷，採室溫下自然陰乾方式。

乾燥後的標本附上採集資料標籤，保存於內置防蟲劑之標本箱。

(三)分類鑑定用玻片標本之製作 　　以15％-20％KOH水溶液將蟲體煮沸5-10分鐘，以清除蟲體之內容物，再以微針鑷子或玻璃毛細管小心解剖分解生殖器各部分，然後依序以50％、75％、90％、95％、100％之乙醇漸進脫水，脫水後之標本先行保存於含甘油之指形管內等待觀察鑑定，待完成後可以Euparal膠封於玻片上，以約50℃之熱板烘烤2週可成永久保存之玻片標本。

翅或解剖生殖器後之腹部，也以同樣方法脫水平壓封膠於玻片上，用以作為翅脈測量用標本或觀察腹部斑紋之型式。

幼蟲頭咽骨標本通常以濃度較低之KOH水溶液(10％以下)室溫浸泡數天或較短時間及較低溫之加熱處理。

(四)特徵之觀察、繪圖及攝影 　　傳統形態主要分兩部份︰大體形態方面以立體顯微鏡及繪圖管作觀察及繪圖，玻片標本則以位相差光學顯微鏡及繪圖管作描記及攝影。

(五)超微構造觀察及攝影 電顯標本之製備 將陰乾之黏貼標本直接以雙面膠黏於觀察臺上，再於熱板上烘乾1-2天。

或使用臨界點乾燥機(LADDCriticalPointDryer)；標本的鍍金使用真空蒸著機(JEOLJEE-400VacuumEvaporator)，厚度約200A左右。

電顯標本之觀察及攝影 本研究使用JEOLJSM-5600ScanningElectronMicroscope機型之掃描式電子顯微鏡作觀察及攝影，主要放大倍率為200X、500X、1,200X、5,000X等。

五、果實蠅與潛蠅類應用結果 　　果實蠅是重要的農業害蟲，也是檢防疫上的重點，但由於許多果實蠅的外形十分相近，難以用肉眼觀察外部形態特徵來區辨種類，故利用外部形態之超微構造來作為區辨之方法，將是一重要之輔助工具。

本研究選擇果實蠅科中危害最嚴重之寡毛實蠅屬（Bactrocera）及優阜實蠅屬（Euphranta）二屬之害蟲，進行掃描式電子顯微鏡超微形態觀察，觀察拍攝部位包括頭、胸、腹、翅以及足等，並特別觀察複眼的小眼間、觸角上、翅上、胸部及腹部背板上的微毛構造，小楯板、平均棍、產卵管上的刻紋、雄性外生殖器，及足的脛節距等。

　　觀察果實蠅頭部時，可發現複眼之小眼間具有一些微毛構造，小眼上有刻紋，用高倍率能清楚的觀察到差異；由於果實蠅不需要像螞蟻在地面搜索，所以觸角感覺毛的種類也比較少，僅在觸刺尚可見到毛的形式有明顯差異。

而胸部背板的微毛構造亦有差異，尤其背板上之的微毛密度上有些不同，但形式上差異較小。

在小楯片上發現各種類的毛孔形式有明顯的不同，具有開發成為形態特徵的潛力。

在翅上可觀察到Sc脈其末端的微毛形式，另外，也可以見到平均棍、足的爪等部位的細微構造；足脛節距（tibiaspur）除了數量上不同之外，在距上具有刻紋構造。

腹部除背板上的微毛觀察外，產卵管及雄性外生殖器的觀察亦是重點之一。

經過整理後發現，複眼小眼間的毛、中胸背板的毛形式及分布、小楯片的毛形式及分布、雌蟲產卵管及雄蟲外生殖器等特徵在不同種類上具有差異性，有可供作屬及或亞屬甚至種級鑑定特徵的潛力。

　　潛蠅科斑潛蠅屬(Liriomyza)昆蟲共計觀察攝影10種，主要超微構造觀察重點包括：頭部微毛、觸角微毛、胸部背板微毛、腹部背板微毛、翅脈超微構造、腹部摩擦發聲器、雄蟲生殖器及幼期超微形態等。

斑潛蠅害蟲主要可以胸部背板微毛列之超微特徵達到鑑別不同種類的目的，其胸背板微毛之形狀長度或密度均有種間的顯著差異性，可以提供為快速鑑定之參考依據。

六、結語 　　在植物防疫檢疫害蟲分類特徵中，形態特徵仍是最基礎、最簡易的一環，但傳統形態在相似種類的區辨上須經驗豐富的分類學者作專業判斷，常有緩不濟急之疑慮。

電子顯微鏡具有高倍率放大及長景深之優點，可凸顯出一般形態觀察無法鑑識之超微特徵，可說為從事昆蟲分類鑑定上之利器。

因此開發超微形態之區辨能力與技術，目的是希望以規格化之處理流程，解決形態鑑定上的問題，建立近緣種害蟲之超微形態圖譜，進一步協助提供非分類工作人員或非擅長該類群之分類學者一簡易準確之鑑定途徑。

未來並可進一步將超微形態特徵圖像轉成數位化影像後，配合其他防疫檢疫資訊系統，建立完整之農業防治、檢疫害蟲資訊。

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