突破原子級解析度：冷凍電顯異軍突起 - The Investigator Taiwan

於是，冷凍式電子顯微鏡（cryo-electron microscopy）粉墨登場，相較之下不需要麻煩的結晶過程，純化的量也僅需0.1 毫克左右。

然而，電子顯微鏡的樣品必須放在真空 ... 首頁關於我們人物訪談 大師專訪 青年學者 海外求職 海外留學與實習 研究領域專題科學報導 生物化學 分子生物學 生物物理與結構生物學 生物物理 結構生物學 基因與基因體學 遺傳學 基因體學 表觀遺傳學 總體基因體學 CRISPR 細胞與發育生物學 發育生物學 癌症生物學 細胞生物學 電生理學 神經科學 計算神經科學 發育神經學 細胞分子神經學 系統神經學 認知科學 微生物與免疫學 微生物學 免疫學 感染性疾病 病毒學 疫苗 生物工程學 合成生物學 生物資訊學 計算生物學 系統生物學 機器與深度學習 蛋白質體學 跨領域生物科技 奈米科技 奈米生物介面 生物材料 醫學 精準醫學 轉譯醫學 細胞治療 基因治療 藥學 藥物開發與設計 再生醫學 幹細胞 組織工程 公共衛生 環境與健康 流行病學 生態與演化 活動 活動消息 大師講座 留學講座 職涯沙龍 專欄 唐獎TangPrize 聯絡我們 自從發明顯微鏡，人類得以一窺肉眼無法看到的世界後，持續追求更高解析度、觀測比細胞更小的奈米尺度結構成了科學家的目標。

在二十世紀前半，電子顯微鏡的發明更是將解析度推進到光學顯微鏡無法看到的病毒與次細胞結構大小。

就算如此，科學家還是不滿意，因為電子顯微鏡的解析度仍無法讓我們看清生物內的巨分子，例如影響蛋白質功能的細部結構。

想要解析蛋白質在原子等級的結構，目前的方法主要有X光晶體繞射（X-raycrystallography）和核磁共振（nuclearmagneticresonance）。

兩者皆有其限制：X光繞射要求樣品必須要先結晶，若結晶困難怕是無法解讀；核磁共振則只能看到小於40-50KDa的物質，同時兩者皆要求樣品必須純化出毫克以上（見結構生物學專題）。

於是，冷凍式電子顯微鏡（cryo-electronmicroscopy）粉墨登場，相較之下不需要麻煩的結晶過程，純化的量也僅需0.1毫克左右。

然而，電子顯微鏡的樣品必須放在真空環境，電子束才不會被空氣分子偏折，樣品通常都必須加以乾燥或用重金屬加以負染色（negativestaining），因此常常無法真實反應分子在生物條件下的真實樣貌。

韓德森（RichardHenderson）、杜波克特（JacquesDubochet）等人的研究發現，我們可以用液態氮快速冷凍樣品，此時樣品中的水分子來不及形成結晶，就這樣凍在原處形成玻璃質，便能以電子顯微鏡觀察生物分子原本的樣貌。

這樣的技術被稱為冷凍式電子顯微鏡，簡稱冷凍電顯（或冷凍電鏡，cryo-EM）。

1968年，德羅西爾（DavidDeRosier）、克盧格（AaronKlug）透過穿透式顯微鏡將同一分子不同方向的2D影像投影重組成3D分子。

將此重組技術加諸冷凍電顯之上，能推算巨分子在生理狀況下的細部構造。

儘管看似前景光明，在1990年代的冷凍電顯技術仍然只能達到40Å之譜，到了2000年左右，此極限已經推進到10Å左右，而2010年時，也只推進到了7-9Å，仍無法和X光繞射匹敵。

基本上在此解析度下，只可見蛋白質大致形狀，細部構造（如beta褶板）仍相當模糊。

直到2013年後，兩項重大的技術革新，彷彿達陣般，將解析度推進至5Å以內，而目前最細部的解析度已達2.5Å。

[1] 第一個突破，是電子偵測器的優化，以新型的直接電子偵測器（directelectrondetector）取代原來的CCD，使得信噪比大幅提升。

第二個突破，是電腦和演算法的進步，讓我們藉由數十萬到百萬個單一分子的2D投影分析還原出3D結構，同時採用「錄影模式」取代原本的「照相模式」，以校正電子對樣品的破壞所造成的模糊畫面。

[2] 於是，冷凍電顯發展了幾十年的能量，就在這幾年內爆炸性地開花結果、造就結構生物學研究與生物物理技術上的重大突破。

而當初的先驅者韓德森、法蘭克（JoachimFrank）、杜波克特等人更是獲得了2017年的諾貝爾化學獎。

圖說：glutamatedehydrogenase在冷凍電顯的解析度變化，從2013年以前（左）到2013年以後（右）解析度已達原子等級。

圖片來源：https://goo.gl/tvUwsv   參考資料： Frank, J.(2017).Advancesinthefieldofsingle-particlecryo-electronmicroscopyoverthelastdecade. NatureProtocols, 12(2),209-212.doi:10.1038/nprot.2017.004 Bai, X.,McMullan, G.,&Scheres, S. H.(2015).Howcryo-EMisrevolutionizingstructuralbiology. TrendsinBiochemicalSciences, 40(1),49-57.doi:10.1016/j.tibs.2014.10.005 林宇軒、曹一允、蔡蘊明（合譯）（2017）。

2017年諾貝爾獎簡介。

取自 https://goo.gl/7CqSCS 撰文│紀威佑 Abouttheauthor 紀威佑 臺大醫學系畢業，曾為臺大iGEM代表隊成員，曾於台大、中研院、AMC實驗室進行實習。

對科普推廣與寫作有很大的興趣，希望能和志同道合的朋友交流，並做為知識的傳播者為科學社群盡一份心力。

Viewallposts Youmayalsolike