膠體過濾

膠體過濾法的膠球 ．    蛋白質構造 蛋白質純化 蛋白質分析 其他連結 巨分子 鹽溶及鹽析 蛋白質定量法 生物技術中心 一級構造 膠體過濾法 酵素活性分析 生物技術核心實驗 二級構造 離子交換法 膠體電泳法 酵素純化與分析 三級構造 親和層析法 免疫轉印法 流程圖 A種 四級構造 純化策略 Proteomics 流程圖 B種　       　 　 　         　  蛋白質純化    　 膠體過濾法 ．蛋白質純化三個階段 　 ．Like dissolveslike ．色層分析法基本原理 ．膠體過濾法的膠球 ．膠體過濾是 partition層析法 ．膠球的堆疊 ．管柱裝填方法    　 　 ■ 蛋白質的純化有三個階段   圖 例 酵素純化過程的各個階段都有其常用的分離純化方法。

純化酵素的第一個步驟，就是打破細胞，把所有的蛋白質分離出來；這多採用鹽析或有機沉澱法，通常可以去除蛋白質以外的大部分物質，有相當大的純化效果，但目標蛋白質可能只佔總蛋白質的百分之一以下。

『部分純化』所使用的方法，幾乎是本實驗課中純化方法的主軸，多使用各種管柱層析法；通常其純度可達 50-90%之間(以蛋白質含量而言)。

為得到少量均質蛋白質，還得利用其他各種純化方法；通常很難定義什麼是均質蛋白質，例如目標蛋白質的水解片段也會影響其純度。

幸而 99% 以上純度的蛋白質，已經可以進行很多實驗，而不會影響結果。

但當製備抗體時，若此 1% 不純物質的抗原性很強，則可能造成抗體效價的低落，或專一性的不足。

 P2A1 ▼ BCT 相關主題 ▲ TOP ■ Likedissolveslike 圖 例 近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同。

若要分類自然界中的所有分子，可以大略分成 極性及非極性兩大類。

極性分子上的電子分佈不均勻，常常造成分子上某些部份的電子密度較大，因而產生偶極性，偶極性會有暫時的正負電荷產生；因此兩個極性分子相遇，可利用其偶極性的正負電荷互相吸引，會有較大的親和力。

反之，非極性的分子上，其電子密度分佈較為均勻，因此不會有偶極產生，事實上非極性分子上不會帶有電荷。

非極性的分子，比較喜歡與非極性的分子接近，可以看作因為無法與極性分子接近，被極性分子排斥所造成的非極性間的相互吸引力量。

但也可以說是分子上電子的短暫分配不均，所形成的 凡得瓦爾吸引力。

為何極性分子上的電子密度分佈會較不均勻？若分子內的任何兩個原子之間，其間的 陰電性相差太大，例如氫(陰電性2.1) 與氧(3.5)，則氫原子上的電子會被氧原子所吸引，使得氫氧附近的電子分佈不均勻。

反之，碳(2.5)與氫(2.1)之間的陰電性相差較小，因此飽和碳氫化合物都是屬於極性較小的分子。

陰電性是描述一個原子搶電子的能力，陰電性大者容易搶奪其相鄰原子的電子。

這是與其原子構造有關，在週期表右方的原子，因為其原子核內的質子數越來越多，正電荷較大，因此吸引電子的能力也較大。

因此，分子的化學性質，幾乎都可用電子的爭奪來解釋；而分子或基團的極性大小，也可解釋大半的生物化學現象。

 P2A2 ▼ BCT 相關主題 ▲ TOP 　 ■ 色層分析法的基本原理圖解 圖 例 色層分析法的系統一定要分有兩相。

  任何種類的色層分析方法，一定有兩個主要組成︰固定相 (stationaryphase)及流動相(mobilephase)，二者各有不同的極性強度；樣本分子因其自身極性的強弱，與此二相之親和力不同。

與固定相親和力大者，易留滯原地；與流動相親和力大者，易隨流動相移動，因而達成分離的目的。

通常流動相為液體或氣體，而固定相可為固體或液體。

若固定相為固體，則稱為吸附性 (adsorption)層析；若為液體，則稱為分配性(partition) 層析。

 P2A3 ▼ BCT 相關主題 ▲ TOP 　 ■ 膠體過濾法的膠球 圖 例 各種膠體層析法的膠球都有許多大小孔洞。

層析法所用的膠體大小要均一，材質堅固而耐得住高壓，並且沒有非專一性的吸附。

膠體過濾的膠球內外，貫穿許多小孔徑的通路，分子量小的粒子，比較容易進入膠球中，因此被延滯流出。

而離子交換法或親和層析法的膠球，其上分布有離子基團或親和基團，可以吸附目標蛋白質，以達分離效果。

分離蛋白質所使用的膠球，必須以 多醣類為主體；例如Sephadex 使用葡萄聚醣，而Sepharose 使用洋菜糖為主要材料。

至於平常所說的樹脂類 (resin) 則只能用在小分子樣本，因為樹脂對蛋白質的吸附力很大，經常會使得蛋白質變性失活。

 P2A4 ▼ BCT 相關主題 ▲ TOP 　 ■ 膠體過濾法是一種partition層析法 圖 例 的的的 膠體過濾法根據樣本的分子大小進行分離 。

膠體過濾法的流動相與固定相都是液體，事實上根本都是同一種緩衝液，只是分成在膠體裡面 (固定相)，與在膠球外面(流動相) 兩個不同的液相，因此是一種partition 層析法。

樣本的分子量小者，因為容易進入膠體中的固定相，因此會被滯留在膠體中，較慢被溶離出來，可以與分子量較大者分離開來。

 P2A5 ▼ BCT 相關主題 ▲ TOP 　 ■ 膠球的堆疊 圖 例 膠球的堆疊要緊密，以降低膠球間的空隙。

膠球在管柱中堆疊，要儘量密實，以便降低膠球間的空間；因為這些空間會造成亂流，並且沒有分離效果。

若把膠球的大小下降，則可以降低此空間，增加膠柱的解析力，但其流率也隨著下降，必須加大壓力以便順利流洗，此即 HPLC(highpressureliquidchromatography)。

因此，HPLC 所用的膠球材質必須很耐壓，多採用陶瓷、矽膠(silica gel)等材料所製成。

 P2A6 ▼ BCT 相關主題 ▲ TOP 　 ■ 管柱的裝填方法 圖 例 多練習膠柱的裝填，並注意檢查所有預先設定的條件。

預先算準所需要的膠體，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠體及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。

另有一些基本的注意事項︰ (1) 膠體裝填時，要一次倒完膠體，儘量不要中斷。

(2) 膠柱裝填完成後要充分流洗，並且使用稍高的壓力，以便使膠體裝填密實。

(3) 勿使膠體乾掉，也注意分劃收集器是否正常運作。

(4) 整個系統的溫度不可改變，尤其不可升溫，否則會產生氣泡；流洗緩衝液的溫度亦同。

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